Generation and analysis of a 29,745 unique Expressed Sequence Tags from the Pacific oyster (Crassostrea gigas) assembled into a publicly accessible database: the GigasDatabase

Background: Although bivalves are among the most-studied marine organisms because of their ecological role and economic importance, very little information is available on the genome sequences of oyster species. This report documents three large-scale cDNA sequencing projects for the Pacific oyster Crassostrea gigas initiated to provide a large number of expressed sequence tags that were subsequently compiled in a publicly accessible database. This resource allowed for the identification of a large number of transcripts and provides valuable information for ongoing investigations of tissue-specific and stimulus-dependant gene expression patterns. These data are crucial for constructing comprehensive DNA microarrays, identifying single nucleotide polymorphisms and microsatellites in coding regions, and for identifying genes when the entire genome sequence of C. gigas becomes available. Description: In the present paper, we report the production of 40,845 high-quality ESTs that identify 29,745 unique transcribed sequences consisting of 7,940 contigs and 21,805 singletons. All of these new sequences, together with existing public sequence data, have been compiled into a publicly-available Website http://public-contigbrowser.sigenae.org:9090/Crassostrea_gigas/index.htm l. Approximately 43% of the unique ESTs had significant matches against the SwissProt database and 27% were annotated using Gene Ontology terms. In addition, we identified a total of 208 in silico microsatellites from the ESTs, with 173 having sufficient flanking sequence for primer design. We also identified a total of 7,530 putative in silico, single-nucleotide polymorphisms using existing and newly-generated EST resources for the Pacific oyster. Conclusion: A publicly-available database has been populated with 29,745 unique sequences for the Pacific oyster Crassostrea gigas. The database provides many tools to search cleaned and assembled ESTs. The user may input and submit several filters, such as protein or nucleotide hits, to select and download relevant elements. This database constitutes one of the most developed genomic resources accessible among Lophotrochozoans, an orphan clade of bilateral animals. These data will accelerate the development of both genomics and genetics in a commercially-important species with the highest annual, commercial production of any aquatic organism

Polymorphisme enzymatique de populations naturelles et experimentales de la palourde europeenne (Ruditapes decussatus) (L.) (Veneridae, Bivalvia)

SIGLET 55116 / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Recherche de marqueurs génétiques et réponse adaptative de l'huître creuse Crassostrea Gigas en condition de stress

Au cours de ces dernières années, des programmes de surveillance d'écosystèmes perturbés ont été élaborés consécutivement à l'augmentation croissante des activités anthropiques. La mise en place de ces programmes s'est accompagné par la recherche de nombreux marqueurs biologiques capables de rendre compte de l'évolution des impacts des pollutions sur les organismes marins aussi bien sur le plan quantitatif (biomarqueurs d'exposition) que sur le plan qualitatif (biomarqueurs de sensibilité). Parmi ces marqueurs biologiques figurent les marqueurs génétiques qui présentent l'avantage de pouvoir être employés comme des outils prédictifs de l'évolution d'un écosystème. L'objectif de ce travail était de développer de nouveaux marqueurs génétiques spécifiques de la réponse adaptative d'un mollusque, l'huître creuse Crassostrea gigas, soumis à des pollutions par des métaux lourds. Deux marqueurs ont ainsi été étudiés : les metallothionéines, protéines impliquées dans la régulation des métaux au niveau de la cellule, et la phosphoglucomutase enzyme impliqué dans le cycle de krebs. Trois gènes codant pour des métallothionéines ont ainsi été caractérises. L'étude des séquences codantes et des promoteurs de ces gènes a révélé des différences de fonctionnalité entre ces métallothionéines et certaines de ces particularités semblent spécifiques de l'espèce. C'est le cas pour la métallothionéine MT2 qui présente un troisième domaine actif qui lui confère une capacité de détoxication supérieure aux autres métallothionéines. L'étude des promoteurs des gènes MT1 et MT2 révèle une possible régulation différentielle basée sur des affinités variables des MRE impliques dans la régulation de la transcription. La caractérisation d'un troisième gène de métallothionéine ne possédant pas d'intron suggère l'existence d'isoformes spécialisées soit dans la régulation homéostatique soit dans la détoxication des métaux lourds. L'étude du polymorphisme exonique des gènes de métallothionéines dans des populations naturelles a permis de mettre en évidence l'existence d'haplotypes qu'il serait possible d'associer avec une meilleure tolérance aux métaux lourds. Ces haplotypes se caractérisent par la présence de mutations au niveau d'acides aminés proches des sites actifs de la protéine. Les travaux réalisés sur la phosphoglucomutase par les techniques de génétique enzymatique ont démontré le caractère sélectionnable de cette enzyme. Les premiers résultats de caractérisation moléculaire de cette enzyme ont permis jusqu'à présent de séquencer une partie de l'ADNc de la protéine chez C. Gigas et ouvrent de nouvelles voies d'étude du polymorphisme de ce gène en fonction de divers paramètres environnementaux (pollution, paramètres physico-chimiques) ou liés à la fitness des individus.Over the past few years, monitoring programs of disturbed ecosystems have increased in number along with the increase in disruptive anthropogenic activities. The establishment of these programs has been associated with the search for biological indicators able to assess the impact of pollutants on marine organisms, in terms of both quantitative effects (indicator of presence) and qualitative effects (indicator of sensitivity). Among these biological indicators, genetic indicators have die advantage of being useful predictive tools of ecosystem evolution. The aim of this work was to develop new genetic indicators that would be specific for the adaptive response of a mollusc, die Pacific oyster Crassostrea gigas, to pollution by heavy metals. Two indicators were studied: die metallothioneins, proteins involved in cellular regulation of metals, and phosphoglucomutase, which is involved in the Krebs cycle. Three genes coding for metallothioneins were characterised. The study of their coding sequences and their promoters revealed some functional differences between the proteins, some of which semm species specific. For instance, the MT2 metallothionein possesses a third active domain, which confers a higher detoxification capacity compared to other metallotbioneins. The study of die MTI and MT2 promoters revealed a potential differential regulation based on the different affinities of the MREs involved in the transcriptional regulation. The characterisation of a third metallothionein gene without intron suggested the existence of isoforms specialized either in homeostasic regulation or in heavy metals detoxification. The study of metallothioenin-gene exon polymorphism in natural populations demonstrated the existence of haplotypes that could be associated with an increased tolerance to heavy metals. These haplotypes are characterised by mutations in amino acids near active sites. Investigation of phosphoglucomutase using allozymic genetic techniques demonstrated the selectionable character of this enzyme. Preliminary results obtained in the molecular characterisation of this enzyme permitted die sequencing of a part of the cDNA in C. gigas and opened new perspectives in the study of polymorphisms in this gene in relation to environmental parameters (pollution or physico-chemical parameters) or linked to the fitness of individuals.BREST-BU Droit-Sciences-Sports (290192103) / SudocSudocFranceF

Réponses écophysiologiques et génétiques de l' huître creuse Crassostrea gigas aux stress environnementaux, en milieu contrôlé et en milieu naturel

L objectif de ce travail est la compréhension des mécanismes de réponse de l huître creuse Crassostrea gigas aux stress environnementaux, Dans un premier temps, les mécanismes moléculaires de réponse à l hypoxie ont été étudiés en milieu expérimental et 616 séquences partielles de gènes impliqués dans la réponse à l hypoxie ont été obtenues. L expression de 10 de ces gènes correspondant à des voies physiologiques majeures a été suivie lors de l exposition et a montré des régulations parfois complexes exercées par l hypoxie. Parmi ces gènes, quatre ont été choisis pour des analyses de polymorphisme : les gènes de la glutamine synthétase, de la delta 9 désaturase, de la peroxiredoxine 6 et d une nouvelle métallothionéine (1114). Des analyses de polymorphisme de ces gènes ont alors été réalisées chez des familles présentant de forts taux de mortalités estivales. Une contre sélection de certains allèles associés à la sensibilité des individus a alors pu être mise en évidence comme conséquence des mortalités différentielles. Le polymorphisme e ensuite été suivi dans des populations d estuaires contaminés de la façade Atlantique française présentant des typologies contrastées. Les mêmes tendances ont été observées. Le suivi de paramètres physiologiques et de la fitness a montré une réponse moléculaire croissante avec la contamination et un coût de la survie. Des couplages phénotypes génotypes ont enfin permis d associer (i) un allèle do la peroxiredoxine 6 à une physiologie défavorable entraînant sa contre sélection on milieu contaminé et (2) des génotypes de la métallothionéine à une plus forte génotoxicité dans les estuaires contaminés (par les métaux notamment)The main objective of this work was the understanding of response mechanisms of cupped oyster Crassostrea gigas 10 environmental stress. First, molecular mechanisms of hypoxia response were studied in experimental conditions, I ve obtained 616 partial sequences of genes involved in hypoxia response. Expression analyses were performed with 10 of these genes corresponding to major physiological pathways, and showed complex regulation exerted by hypoxia. Four genes were chosen for polymorphism analyses: glutamine synthetase, delta 9 desaturase, peroxiredoxin 6 and a new metallothionein (MT4) genes. Polymorphism analyses were performed for these genes on families showing high summer mortality level, Some alleles associated to individuals susceptibility were counter selected, as a consequence of differential mortality. Polymorphism of the same candidate genes was followed in populations from contaminated estuaries of the Atlantic French coast. Same tendencies were observed. Physiological parameters showed an enhanced mclecular response with contamination and a cost of survival. Phenotypes genotypes coupling allowed to associate (I) a peroxiredoxin 6 allele with a bad physiological state leading to counter selection in contaminated areas, and (2) metallothionein 4 genotypes with a higher genotoxicity in contaminated estuaries (with heavy metals notably).BREST-BU Droit-Sciences-Sports (290192103) / SudocPLOUZANE-Bibl.La Pérouse (290195209) / SudocSudocFranceF

Peroxiredoxin 6 gene: Anewphysiological and geneticindicator of multipleenvironmentalstressresponse in PacificoysterCrassostrea gigas

International audiencePeroxiredoxin 6 is a 1-cysteine peroxiredoxin involved in antioxidant processes. We characterised the full-length cDNA and genomic sequence of the gene encoding peroxiredoxin 6 (CgPrx6) in the Pacificoyster, Crassostrea gigas. A phylogenetic analysis of Prx6 sequences showed that the CgPrx6 segregates between vertebrate and invertebrate groups. We analysed the expression of mRNA coding for CgPrx6 using RT-PCR in gills and digestive gland of oysters sampled in different contaminated and reference estuaries of the Atlantic French coast. We also studied CgPrx6 exon 6 polymorphism by PCR-SSCP in the same populations. Our results showed that CgPrx6 gene expression was highly regulated in the estuaries showing differential contamination levels, as expression increased with pollution level. Polymorphism analysis revealed no significant allelic frequency variations between populations. However, heterozygote deficiency seems to occur in the most contaminated estuaries, suggesting a potential selective effect of environmentalstress on heterozygote frequency. Finally, the use of CgPrx6 as a possible marker to monitor stress exposure in disturbed ecosystems is discussed

Characterisation and genetic polymorphism of metallothionein gene CgMT4 in experimental families of Pacific oyster Crassostrea gigas displaying summer mortality

International audienceSummer mortality events have been observed in Pacific oyster Crassostrea gigas for several decades. This paper examines the selective pressure exerted by summer mortality on the polymorphism of a newly identified oyster metallothionein gene. CgMT4 cDNA and genomic sequences were obtained. CgMT4 was studied in two generations of oysters reared in three sites on the French Atlantic coast, using single strand conformation polymorphism analysis. Four alleles were detected. Individuals carrying genotype MT4-CD seem to have higher susceptibility to summer risk conditions. The MT4 gene could be a potential new genetic marker for susceptibility; further validation studies are recommended

Effect of copper on the immunomodulatory activities of haemocytes in juveniles of the abalone Haliotis rufescens cultivated under hatchery conditions

International audienceThe effect of short-term exposure to copper on the cellular and physiological response in haemocytes of juvenile abalone Haliotis rufescens cultivated in hatcheries in the north of Chile is evaluated. The animals were exposed for 168 hours to concentrations of 2.5 μg/L and 10 μg/L of Cu+ 2, which have been reported as representative of coastal zones close to mining activity, particularly copper mining. The haemocytes were collected from the animals and the effect of the metal was quantified through the total haemocyte count (THC), phagocytosis, phenoloxidase activity, and generation of superoxide anions. The results showed that copper exposure decreased THC and phagocytosis significantly, while phenoloxidase activity and superoxide anions production increased significantly with respect to untreated controls. This study suggests a relation between exposure to the trace copper concentrations and the alterations of in vitro cellular and physiological parameters of the abalone's immune system in a dose- and time-dependent manner. This study emphasize the importance of heavy metal contamination on abalone cultures considering that the haemocytes are crucial for the proper function of the immune system and important health indicators to evaluate the effect of ambient stress factors on these organisms

Génétique biochimique de populations de

En utilisant la technique de l'électrophorèse sur gel d'amidon, la variabilité génétique de 16 populations de Crassostrea gigas naturalisées ou cultivées sur les côtes atlantiques françaises ont été comparées à une population de Miyagi (Japon). Les résultats de fréquences alléliques obtenus pour 13 locus analysés dans les 17 populations examinées, ont montré 4 locus monomorphes pour le même électromorphe pour les populations françaises et seulement 3 pour la population japonaise. Deux allèles particuliers (Aat-190 et αGpd-1112) ont été décelés dans la population japonaise. Cependant, les fréquences des allèles les plus communs pour chaque locus sont les mêmes en France et au Japon et les critères de variabilité génétique (taux de polymorphisme, taux d'hétérozygotie, nombre moyen d'allèle par locus) qui sont très élevés, sont du même ordre au Japon et en France, y compris pour une population originaire d'écloserie. Les critères d'identité génétique ont montré une similarité très forte entre la population du Japon et celle de France. Parmi celles-ci, quatre populations d'estuaires ont montré certains génotypes particuliers mis en évidence par analyse factorielle des correspondances

Immunochemical quantification of metallothioneins in marine mollusks: Characterization of a metal exposure bioindicator

International audienc

Trace metal and biomarker levels in tissues of

The capacity to bioaccumulate trace metals present in San Jorge Bay, Antofagasta, Chile, was determined in northern scallop, Argopecten purpuratus, to examine the value of this important commercially species as a bioindicator of heavy metal pollution in areas where it is cultured. Scallops were sampled in summer 2009 in four sites: three natural populations (Coloso, Historic District and La Rinconada, marine reserve), and a commercial hatchery (Colorado). The concentrations of three heavy metals (copper, cadmium and lead) were then determined through stripping chronopotentiometric methods, and the levels of four biomarkers: three genes implicated in the stress and oxidative metabolism, i.e., glutathione peroxidase (GPx), glutathione s-transferase (GST) and heat shock protein 70 (HSP70), and a protein marker in the digestive gland and gill, a metallothionein (MT). The Historic District, located in the downtown area of the city, showed the highest metal concentration of all the sampled sites, as well as the highest levels of the four biomarkers. This can be largely attributed to the nearby international port area of the town and high sea traffic flow, exacerbated by the prevailing winds